Nos péptidos sintéticos, são habituais duas análises: a HPLC para a pureza e a espectrometria de massa (MS) para a identidade. Existem ainda testes complementares: o teor líquido de péptido, as endotoxinas (com o teste LAL ou rFC), os metais pesados e outros elementos (com ICP-MS ou ICP-OES), os solventes residuais e o contraião trifluoroacetato (TFA). Os testes realizados a um lote constam do certificado de análise (COA). Se um teste não constar do certificado, parta do princípio de que não foi realizado.
Pureza, teor e identidade
A pureza mede-se por HPLC. O resultado é a área do pico principal em percentagem de todos os picos que o detetor regista. «99% de pureza» significa, portanto, que 99% do sinal UV corresponde ao péptido correto. Não diz que parte do pó é péptido.
O teor líquido de péptido responde a essa segunda pergunta: que parte do pó pesado é realmente péptido? O pó de péptido liofilizado contém, além do péptido, água e contraiões, como o trifluoroacetato (TFA) proveniente da purificação por HPLC [5]. O teor é determinado à parte, por exemplo por análise de aminoácidos, e o teor de água muitas vezes pelo método de Karl Fischer. Para os investigadores, isto é importante: quem calcula uma concentração com base na quantidade de pó pesada, sem este dado, obtém um valor demasiado alto.
A identidade confirma-se por espectrometria de massa. A massa medida deve corresponder à massa teórica do péptido. Como ler os resultados de HPLC e de MS num certificado é explicado em Ler um certificado de análise (COA).
Endotoxinas: o teste LAL e o fator C recombinante
As endotoxinas são lipopolissacáridos (LPS) da parede celular de bactérias gram-negativas. São libertadas durante a divisão celular e quando as bactérias morrem. No sangue, desencadeiam uma forte reação inflamatória do sistema imunitário; por isso, são controladas por rotina na indústria farmacêutica [1]. Também na investigação laboratorial podem interferir: uma reação das células às endotoxinas pode ser erradamente atribuída ao péptido em estudo.
- Teste LAL. O teste mais utilizado usa um extrato de células sanguíneas do límulo, o caranguejo-ferradura (Limulus amebocyte lysate). Nesse extrato, a endotoxina desencadeia uma reação de coagulação que pode ser medida [1].
- Fator C recombinante (rFC). Uma alternativa sem sangue animal. Utiliza uma versão do fator C, uma enzima de coagulação do límulo, produzida em laboratório (recombinante). Como o rFC não reconhece a chamada via do fator G, reage de forma mais específica às endotoxinas. Em estudos comparativos, os resultados foram muito concordantes com os do teste LAL [2].
O resultado é expresso em UE (unidades de endotoxina) por miligrama ou por mililitro. Atenção: algumas soluções podem mascarar as endotoxinas, de modo que o teste encontra menos do que existe. Este fenómeno chama-se low endotoxin recovery [1]. Por isso, um teste de endotoxinas fiável é validado para o produto específico.
Metais pesados e outros elementos: ICP-MS
Nos medicamentos, fala-se hoje de «impurezas elementares». Segundo a diretriz internacional ICH Q3D, podem provir de catalisadores da síntese, do contacto com equipamentos de produção ou embalagens, ou de outros componentes [4]. A diretriz classifica os elementos em classes. A classe 1 é constituída pelo arsénio, cádmio, mercúrio e chumbo: elementos tóxicos que pouco ou nada se utilizam na produção [4].
Antigamente fazia-se um «teste de metais pesados» genérico. Desde a ICH Q3D, esse teste foi substituído por uma avaliação de risco e por medições com técnicas baseadas em plasma indutivamente acoplado: ICP-OES e ICP-MS [3]. A ICP-MS é a mais sensível e é necessária sobretudo para determinar com exatidão baixas concentrações de arsénio e de chumbo [3]. Um certificado deve indicar, para cada elemento, o valor medido e a técnica utilizada.
Solventes residuais e TFA
Os solventes residuais são substâncias orgânicas voláteis utilizadas ou formadas na produção que não desaparecem por completo. A diretriz ICH Q3C classifica-os em três classes: classe 1 (a evitar), classe 2 (a limitar; inclui o acetonitrilo) e classe 3 (baixa toxicidade, como o etanol e o ácido acético). São geralmente medidos por cromatografia gasosa [4].
O TFA (ácido trifluoroacético) é usado como solvente na purificação por HPLC. Por isso, os péptidos purificados são muitas vezes um sal de TFA [5]. Num estudo clássico, o TFA em baixas concentrações inibiu o crescimento de células ósseas e de cartilagem em cultura. Isso podia mascarar um efeito do próprio péptido ou, pelo contrário, sugerir um efeito que não existia. Os investigadores recomendaram converter os péptidos destinados a experiências celulares num cloridrato ou num sal semelhante [5]. Se um certificado não indicar a forma de sal, peça essa informação.
O que deve constar de um bom certificado de análise
- O número de lote, igual ao número do rótulo, a data da análise e o nome do laboratório.
- A pureza por HPLC, de preferência com o cromatograma e o comprimento de onda utilizado.
- A identidade por MS: a massa medida ao lado da massa teórica.
- A forma de sal (por exemplo, TFA ou acetato) e, se tiverem sido determinados, o teor líquido de péptido e o teor de água.
- Para cada teste complementar, como endotoxinas, elementos ou solventes: o método, a unidade e o valor medido.
Na Clean Peptides, cada frasco e cada caneta tem o número de lote no rótulo. Tem uma pergunta sobre a análise de um produto que encomendou? Contacte-nos e indique o número de lote.
Produtos e leituras recomendadas
Produtos
A gama completa está disponível na loja, por exemplo BPC-157 10 mg, TB-500 10 mg, GHK-Cu 100 mg e MOTS-c 10 mg.
Leituras recomendadas
- Ler um certificado de análise (COA)
- O que é o KLOW? A mistura de péptidos explicada
- O que são péptidos? Explicação e conceitos-chave
- Research use only (RUO)
- Base de conhecimento: péptidos e material de investigação explicados
Fontes
- Gorman A, Golovanov AP. Lipopolysaccharide Structure and the Phenomenon of Low Endotoxin Recovery. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics 2022;180:289–307. doi:10.1016/j.ejpb.2022.10.006
- Bolden J, Knutsen C, Levin J, et al. Currently Available Recombinant Alternatives to Horseshoe Crab Blood Lysates: Are They Comparable for the Detection of Environmental Bacterial Endotoxins? A Review. PDA Journal of Pharmaceutical Science and Technology 2020;74(5):602–611. doi:10.5731/pdajpst.2020.012187
- Janchevska K, Stafilov T, Memed-Sejfulah S, et al. ICH Q3D based elemental impurities study in liquid pharmaceutical dosage form with high daily intake – comparative analysis by ICP-OES and ICP-MS. Drug Development and Industrial Pharmacy 2020;46(3):456–461. doi:10.1080/03639045.2020.1724136
- ICH. Guideline for elemental impurities Q3D(R2) (2022) e Impurities: guideline for residual solvents Q3C(R9) (2024). Q3D(R2) · Q3C(R9) (consultado a 30 de setembro de 2026)
- Cornish J, Callon KE, Lin CQ, et al. Trifluoroacetate, a contaminant in purified proteins, inhibits proliferation of osteoblasts and chondrocytes. American Journal of Physiology 1999;277(5):E779–E783. doi:10.1152/ajpendo.1999.277.5.E779
Exclusivamente para investigação laboratorial. Os produtos da Clean Peptides não se destinam a utilização em pessoas nem em animais. Este artigo contém informação geral e não constitui aconselhamento médico.
