En los péptidos sintéticos hay dos análisis habituales: la HPLC para la pureza y la espectrometría de masas (MS) para la identidad. Además existen pruebas complementarias: el contenido peptídico neto, las endotoxinas (con el ensayo LAL o rFC), los metales pesados y otros elementos (con ICP-MS o ICP-OES), los disolventes residuales y el contraión trifluoroacetato (TFA). Qué pruebas se han hecho a un lote se ve en el certificado de análisis (COA). Si una prueba no figura en él, da por hecho que no se ha realizado.
Pureza, contenido e identidad
La pureza se mide con HPLC. El resultado es el área del pico principal como porcentaje de todos los picos que ve el detector. «99 % de pureza» significa, por tanto, que el 99 % de la señal UV corresponde al péptido correcto. No dice qué parte del polvo es péptido.
El contenido peptídico neto responde a esa segunda pregunta: ¿qué parte del polvo pesado es realmente péptido? Además del péptido, el polvo liofilizado contiene agua y contraiones, como el trifluoroacetato (TFA) procedente de la purificación por HPLC [5]. El contenido se determina por separado, por ejemplo con un análisis de aminoácidos, y el contenido de agua, a menudo con el método de Karl Fischer. Para los investigadores es importante: quien calcula una concentración a partir de la cantidad de polvo pesada obtiene, sin este dato, un valor demasiado alto.
La identidad se confirma con espectrometría de masas. La masa medida debe coincidir con la masa teórica del péptido. Cómo leer los resultados de HPLC y MS en un certificado lo explicamos en Cómo leer un certificado de análisis (COA).
Endotoxinas: el ensayo LAL y el factor C recombinante
Las endotoxinas son lipopolisacáridos (LPS) de la pared celular de las bacterias gramnegativas. Se liberan cuando las bacterias se dividen y cuando mueren. En la sangre provocan una fuerte reacción inflamatoria del sistema inmunitario; por eso, en la industria farmacéutica se controlan de forma rutinaria [1]. También pueden interferir en la investigación de laboratorio: una reacción de las células a la endotoxina puede atribuirse por error al péptido estudiado.
- Ensayo LAL. La prueba más utilizada emplea un extracto de células sanguíneas del cangrejo herradura (Limulus amebocyte lysate). La endotoxina desencadena en ese extracto una reacción de coagulación que puede medirse [1].
- Factor C recombinante (rFC). Una alternativa sin sangre animal. Utiliza una versión del factor C, una enzima de coagulación del cangrejo herradura, producida en el laboratorio (recombinante). Como el rFC no reconoce la llamada vía del factor G, reacciona de forma más específica a la endotoxina. En estudios comparativos, sus resultados coincidieron en gran medida con los del ensayo LAL [2].
El resultado se expresa en UE (unidades de endotoxina) por miligramo o por mililitro. Atención: algunas soluciones pueden enmascarar la endotoxina, de modo que la prueba detecta demasiado poca. Este fenómeno se llama low endotoxin recovery (baja recuperación de endotoxina) [1]. Por eso, una prueba de endotoxinas fiable está validada para el producto concreto.
Metales pesados y otros elementos: ICP-MS
En los medicamentos se habla hoy de «impurezas elementales». Según la directriz internacional ICH Q3D, pueden proceder de catalizadores de la síntesis, del contacto con equipos de producción o envases, o de otros componentes [4]. La directriz clasifica los elementos en clases. La clase 1 la forman el arsénico, el cadmio, el mercurio y el plomo: elementos tóxicos que apenas se utilizan, o no se utilizan, en la producción [4].
Antes se hacía un «ensayo de metales pesados» general. Desde la ICH Q3D, se ha sustituido por una evaluación de riesgos y por mediciones con técnicas basadas en el plasma de acoplamiento inductivo: ICP-OES e ICP-MS [3]. La ICP-MS es la más sensible y resulta especialmente necesaria para determinar con precisión concentraciones bajas de arsénico y plomo [3]. Un certificado debe indicar, para cada elemento, el valor medido y la técnica utilizada.
Disolventes residuales y TFA
Los disolventes residuales son sustancias orgánicas volátiles que se utilizan o se forman durante la producción y no desaparecen por completo. La directriz ICH Q3C los clasifica en tres clases: clase 1 (deben evitarse), clase 2 (deben limitarse; aquí se incluye el acetonitrilo) y clase 3 (baja toxicidad, como el etanol y el ácido acético). Suelen medirse por cromatografía de gases [4].
El TFA (ácido trifluoroacético) se utiliza como disolvente en la purificación por HPLC. Por eso, los péptidos purificados suelen ser una sal de TFA [5]. En un estudio clásico, el TFA en concentraciones bajas inhibió el crecimiento de células óseas y cartilaginosas en cultivo. Eso podía enmascarar un efecto del propio péptido o, al contrario, sugerir un efecto inexistente. Los investigadores recomendaron convertir los péptidos destinados a experimentos celulares en clorhidrato o una sal similar [5]. Si un certificado no indica la forma salina, pregunta por ella.
Qué incluye un buen certificado de análisis
- El número de lote, igual al de la etiqueta, además de la fecha del análisis y el nombre del laboratorio.
- La pureza por HPLC, preferiblemente con el cromatograma y la longitud de onda utilizada.
- La identidad por MS: masa medida junto a la masa teórica.
- La forma salina (por ejemplo TFA o acetato) y, si se han determinado, el contenido peptídico neto y el contenido de agua.
- Para cada prueba complementaria, como endotoxinas, elementos o disolventes: el método, la unidad y el valor medido.
En Clean Peptides, cada vial y cada pluma (PEN) llevan el número de lote en la etiqueta. ¿Tienes alguna pregunta sobre el análisis de un producto que has pedido? Ponte en contacto con nosotros e indica el número de lote.
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Fuentes
- Gorman A, Golovanov AP. Lipopolysaccharide Structure and the Phenomenon of Low Endotoxin Recovery. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics 2022;180:289–307. doi:10.1016/j.ejpb.2022.10.006
- Bolden J, Knutsen C, Levin J, et al. Currently Available Recombinant Alternatives to Horseshoe Crab Blood Lysates: Are They Comparable for the Detection of Environmental Bacterial Endotoxins? A Review. PDA Journal of Pharmaceutical Science and Technology 2020;74(5):602–611. doi:10.5731/pdajpst.2020.012187
- Janchevska K, Stafilov T, Memed-Sejfulah S, et al. ICH Q3D based elemental impurities study in liquid pharmaceutical dosage form with high daily intake – comparative analysis by ICP-OES and ICP-MS. Drug Development and Industrial Pharmacy 2020;46(3):456–461. doi:10.1080/03639045.2020.1724136
- ICH. Guideline for elemental impurities Q3D(R2) (2022) e Impurities: guideline for residual solvents Q3C(R9) (2024). Q3D(R2) · Q3C(R9) (consultado el 30 de septiembre de 2026)
- Cornish J, Callon KE, Lin CQ, et al. Trifluoroacetate, a contaminant in purified proteins, inhibits proliferation of osteoblasts and chondrocytes. American Journal of Physiology 1999;277(5):E779–E783. doi:10.1152/ajpendo.1999.277.5.E779
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